3개월전에 조국 전장관님 관련글에 모두 등판하며 까내리는 일베충이랑 모공에서 싸우다가 3개월정지먹어서..
클리앙에는 못썼고 다른사이트에만 적엇었는데..
이미 조국 전장관님 관련 쟁점은 다른곳으로 옮겨간뒤라..
이 논문얘기는 뒷북인거같지만
오늘 3개월 정지 만기 출소해서,..
그래도 복붙은해봅니다..
그냥 해당논문 가지고 싸움은 많이일어나는데 정작 어떤내용의 논문인가는 이해하는사람이 적어보여서 그냥 최대한 쉬운말로 설명해볼려고 노력해본글입니다.
참고로 저는 학부 생화학 대학원 약학전공했고요
학부 대학원 사이 gap year에 research associate으로 일하면서 PCR을 하도자주했었기에.. 그냥 잘아는 부분이야기나와서 굳이글을써보는겁니다
우선
해당 문제의 논문의 제목과 초록(abstract)입니다.
영어로 되어있으니 번역기한번 돌려보겠습니다(귀찮기도하고 교과서말투는 번역기도일잘해서..).
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eNOS 선천성 저산소-이혈성 뇌병증의 유전자 다형성
배경 : 주 산기 저산소 성 허혈성 뇌병증 (HIE)에서 뇌 혈류는
산화 질소 시타 제 (NOS)의 활성이 손상되고 활성이 현저히 증가된다. 뇌졸중 발생과 관련하여 내피 NOS (eNOS) 다형성이 잘 알려져있다.
방법 : eNOS 유전자의 임상 적으로 관련된 3 가지 다형성
주 산기 HIE (HIE 군)가있는 37 명의 조산아와 신생아가 54 명
제한 단편 효소 소화의 유무에 관계없이 중합 효소 연쇄 반응을 사용하는 임의의 주 산기 문제 (대조군). 유전자형, 대립 유전자 및 일배 체형 빈도의 차이를 그룹간에 평가 하였다.
결과 : 대립 유전자 빈도 분석 결과, Glu298Asp의 G 대립 유전자가 HIE 그룹에서보다
컨트롤. 컨트롤과 각 하위 그룹 간의 합병증 비교
HIE에서 발생한 것은 T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자가 신생아의 폐동맥 고혈압 (PPHN) 환자에서 더 흔함을 보여 주었다.
통제 수단. A b T 일배 체형의 빈도는 대조군보다 HIE 환자에서 더 낮았다. 결론 : Glu298Asp의 G 대립 유전자는 주 산기 HIE와 관련이있는 반면
T-786C의 TC 유전자형 및 C 대립 유전자는 PPHN과 관련이 있었다.
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한글로 써져있지만 자세히 안읽으면 이해하기가 힘든문장이기떄문에 이해를 돕기위해 몇가지 내용을 설명해보겠습니다.
배경지식
1.HIE 허혈설 저산소뇌병증
이 논문은 특정 질병에대해다루는 병리학논문이니까 제일 처음으로 알아야할 개념은
HIE가 무슨질병인가?를 알아야한다고 생각할수도있는데..
이 논문을 기획하는 입장에서는 물론 해당질병에대한 배경지식이있어야하지만
사실 이논문을 이해하는데에있어서 HIE가 어떤병인지를 굳이 알아야할필요는 없습니다.
그이유는 이 글을 다읽으셨을때에 이해하게될겁니다.
2. Polymorphism
이 논문을 이해하기 위해서 알아야하는 제일 첫번째 개념은 polymorphism입니다.
Polymorphism 유전적 다형성은
쉬운말로 설명하자면 같은 종의 생명체간에도 각각의 개체들의 유전자는 조금씩다르단겁니다.
사람으로 예를들면
누구는 곱슬머리이고 누구는 긴머리이고
원빈은 잘생겼지만 저는 못생긴것처럼..
같은 호모사피엔스여도 각각의 개체들의 유전자는 조금씩 다르다는게 이 polymorphism입니다
3. eNOS
이 논문은 Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS)라는
인체내에서 Nitric Oxide (산화질소)를 합성하는 효소에 관한내용을 다루는데요.
사람마다 눈모양이다르고 코모양이 다르듯이 (위에서 설명한 polymorphism)
이 eNOS라는 효소도 사람마다 조금씩 다르다는것이 이 논문을 읽어야하는데 알아둬야하는 내용입니다.
이 효소를 이루는 298번째 아미노산이 어떤사람은 Glutamate이고 어떤사람은 Aspartate으로 되어있는데
Glu인지 Asp인지에따라서 산화질소 합성능력과 각종질병에 영향이있다는건 이미 기존에 알려진사실이라고
이 논문은 일단설명하고요
이 298번쨰 아미노산이 Glu인지 Asp 인지의 여부가 HIE라는 특정 질병의 연관성이 있는가를 연구한게 바로 이 논문입니다.
실험방법
이제 이 논문이 무엇을 연구하고 밝혀내려고한건지는 충분히 설명했으니..
어떤실험을 통해 어떻게 밝혀낸것인가에 대해 얘기해보겠습니다.
1. 혈액채취
우선 제일먼저 이 실험에서 진행된일은
91명의 신생아로부터 혈액샘플을 얻어낸것입니다
이 91명중에서 37명은 HIE라는 병을 겪고있는 신생아와 미숙아이고
나머지 54명은 정상적인 신생아입니다.
혈액채취는 2002년부터 2004년 2년에걸쳐서 단국대 의료진에 의해 채취되었다고 논문에 밝혀져있습니다
2. DNA 추출
혈액샘플을 얻었으니 이제 연구진이 그 다음으로 한일은 혈액으로부터 DNA를 추출하는일입니다.
DNA extraction 자체는 간단한작업이기도하고 그냥 DNA추출이라는 말이 이해가 안될리는 없을테니...
이 부분에 대한 설명은 생략하겠습니다
3. Polymerase Chain Reaction
줄여서 PCR (중합 효소 연쇄반응)은 얻어진 DNA를 분석하기전에 분석하기좋겠금 샘플을 복제 및 증폭시키기 위해 행해지는 실험입니다.
이 PCR의 원리를 설명할려면 몇가지 배경지식이있는데
우선 DNA는
아데닌, 타이 민, 구아닌, 사이토신
네개의 베이스로 구성이되어있습니다.
각각 줄여서
A T G C로 표현을하는데요
DNA에 이 네개의 베이스가 어떤순서대로 배치되어있냐에 따라서 다른 유전자정보를 가지게됩닏
예를들면
ATAACGTACCTAGCCAAACCCGGGGGGTTAAC라는 패턴의 DNA와
CTAACAGTAAGCATGGAAAACCCGGAGATACC라는 패턴의 DNA는 서로 다른 유전자 정보를 가지고있습니다
그리고 A-T는 수소결합을 이루고
G-C도 수소결합을 이루어서
DNA는 나선두개가 수소결합으로 서로 붙어있는 이중나선 구조인데요
이 DNA를 가열하면 수소결합이 깨져서 두개의 나선이 한짝 한짝씩 떨어지게되는데 이를 single stranded DNA (ssDNA)라고하고
이게 다시식으면 다시 이중나선 (double stranded)으로 돌아가는데 이를 이중나선인상태를 dsDNA라고합니다
그럼 다시 PCR로 돌아가보면요
PCR의 원리는 생각보다 매우간단합니다.
예를들어서
라는 패턴을 가진 DNA를 증폭할려고하면
PCR용 테스트튜브 (dNTP 버퍼 MgCl DNA Polymerase등이 들어있음)에 DNA샘플과 Primer를 넣고 가열을합니다
그러면 이중나선을 이루는 수소결합이 꺠짐에 따라 dsDNA한개가 쪼개져서 두개의 ssDNA가 됩니다.
이걸 다시 식혀주면 원래대로라면 ssDNA 두개가 들러부어서 다시 dsDNA가 되어야하지만
이경우에는 primer가 들어있어서 ssDNA두개가 들러붙는거아니라
아래 그림과같이
ssDNA에 primer가 들러붙게됩니다
Primer가 뭔지 설명해보자면
A에는 T가붙고
C에는 G가 붙는
DNA의 성질을 고려해서 실험전에 미리 내가 관심있는 DNA에 들러붙도록 디자인해둔 일종의 미완성 DNA조각이라고 보면됩니다.
그러면 이 다음에는
DNA Polymerase가 DNA에 들러붙고 dNTP를 primer의 뒷부분에 부착하여서
미완성인 DNA의 뒷부분을 완성해나갑니다.
그래서 결과적으로
이렇게 처음에 한개였던 DNA가 두개로 복제되어서 증폭되게됩니다.
과정을 여러번 반복을하면 (한번반복한거를 1 cycle이라합니다)
n cycle반복햇을때 2^n배만큼의 복제된 DNA를 얻을수가있죠.
참고로 이 논문에서는
5′-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3′ 와
5′-CCC AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA-3′ 라는 패턴의 primer를 쓰면
eNOS의 유전자를 중폭할수있다는게 이미 선행연구를 통해 밝혀져있었던 상태라
별도의 primer 디자인과정없이 그냥 기존에 알려진 primer를 쓸수있었습니다.
원리는 조금복잡해보일수도있지만...
PCR용 테스트튜브를 구한다 -> DNA를 테스트튜브에넣는다 -> primer를 테스트튜브에 넣는다 -> PCR기계에넣는다
기계가 알아서 가열->식힘->가열->식힘을 반복해준다 -> DNA가 복제되어있다
라는 매우 간단한 과정이 이 논문에서 실행된 PCR step에서 실행되었습니다.
그럼 증폭된 DNA를 어디에 쓰는가? 를 설명할려면
다음 과정으로 넘어가야합니다
4. restriction enzyme으로 DNA처리
restriction enzyme은 특정위치에서 DNA를 잘라주는 효소입니다
이 실험에서는
5-GRGCY /C- 3'
3' C/YCGRG-5'
이라는 특정패턴에서 DNA를 잘라주는 Ban II라는 restriction enzyme이 사용되었는데요
이게 무슨의미인가 설명해보자면
아래 그람과 같습니다
그림에서 보이듯이 특정한 패턴이 있는곳에서 restriction enzyme이 DNA를 잘라주었죠
이게 restriction enzyme의 역할인데
이걸 어떻게응용하냐하면요
사람마다 DNA 패턴은 조금씩다릅니다
만약 DNA가 1000개인데
사람1은 300번째에 해당패턴이있고
사람2는 500번째에 해당패턴을가지고있다면 각각의 DNA에 restriction enzyme넣으면
사람1의 DNA는 길이가 300과 700인 DNA 조각 두개로 잘라질것이고
사람2의 DNA는 길이가 500과 500인 DNA조각 두개로 잘라지겟죠
참고로 이 과정은 어떤 restriction enzyme을써야하냐만 아는상태라면 정말간단한작업으로 DNA들어있는 테스트튜브에 restriction enzyme 파이펫으로 아주조금 첨가해주면 끝나는 작업입니다.
(이 논문의 경우 선행연구를 통해 Ban II쓰면된다고 이미 알려져있었습니다.)
이렇게 잘려진 DNA가 대체 어디에 쓰이는거냐라고하면 5번으로가야하는데요
5. 전기영동
DNA는 기본적으로 (-) charge를 가집니다.
그래서 전기가 흐르면 DNA는 +극쪽을 향해 이동을해요.
그래서 이러한 장치에다가 위에서 잘려진 DNA혼합물을 넣고 전기를 흘려주면
DNA들은 +극쪽으로 이동을하게되죠
그런데 이떄 이동하는속도는 DNA의 크기가 클수록 느리게 작을수록 빠르게 이동합니다
위에서 잘려진 300개짜리와 700개짜리가 섞여있는 DNA를 여기넣고 돌리면
300개짜리는 더멀리이동하고 700개짜리는 더적게이동을해서
서로 분리가되니까 그걸보고 아 이사람은 DNA가 잘려지는 패턴이 어디어디에있구나하는걸 알수잇고
그걸통해 유전자 비교가 가능합니다.
이건 해당논문에 실제로 첨부되어있던 전기영동 결과물 사진인데요.
이 실험에서는
298번쨰 아미노산이 무엇인가에따라
DNA가 잘리는 패턴을 포함하지않아서 안잘려서 DNA 가 258bp그대로이거나
혹은
잘리는 패턴을 포함해서 163bp와 85bp 두개로 (bp는 DNA 길이를 나타내는 단위입니다) 잘리는 케이스 두개로 나뉘는데요
85bp는 작기떄문에 더멀리 이동하였고 163bp는 중간 사이즈라 중간만큼 이동하였고
258bp는 커서 조금이동한것을 볼수있고
이 전기영동의 결과에따라서 해당 DNA의 주인인 환자의 298번째 아미노산이 무엇인지 유전자 분석을 할수있는것이지요.
결론부분
실험을통해 91명의 신생아들의 유전자 분석을 끝냈기때문에
각각의 신생아들의 298번째 유전자가 Glu인지 Asp인지 이제 알게되었습니다.
그래서 HIE환자중에 Glu가몇명이고 Asp가몇명인지
정상신생아중에 Glu가 몇명인지 Asp가 몇명인지
SPSS라는 비교적 간단한 통계툴을 통해 카이스퀘어 테스트를 돌린결과
HIE라는 질병이 있는 신생아들에게서 Glu298Asp 를 가지는 G allele이 정상적인 신생아들에서보다 더 많이 발견되었다
라는 결론이 내려진겁니다.
요약을 하자면
0. HIE란 질병과 eNOS polymorphism에 대한 간단한 배경설명
1. 91명의 신생아들에게서 혈액채취
2. 혈액에서 DNA 분리
3. DNA를 PCR을 통해 복제및 증폭
4. 3에서얻어진 DNA를 Restriction Enzyme으로 특정위치를 자름
5. 4에서얻어진 DNA를 전기영동으로 분석
6. SPSS로 91명 환자들은 298번 아미노산의 종류에따라 분류해서 결론도출
이것이 이 논문이 담고있는 내용입니다
여기까지가 해당논문이 다룬 내용을 설명을 한것이고
이 실험의 어디서부터 어디까지를 고등학생이 수행할수있는가에 대해 개인적인 의견을 써보자면
우선
PCR 이론에 대한 이해
전기영동 이론에 대한 이해
Restriction Enzyme 이론에 대한 이해
polymorphism에 대한 이해
그리고
PCR 실험 진행
전기영동 실험진행
Restriction Enzyme으로 DNA처리
이것들은
고등학생이 충분히 이해할수있고
직접 실험을 진행할수있는부분입니다.
애초에 제가 이 글에다가 설명을 할수있을정도로 어려운내용도아닐뿐더러
미국의 경우는 고등학교때 AP Biology 에서 위에서 언급한 PCR, Polymorphism, Restriction Enzyme, 전기영동 모두 다 배웁니다
그리고 조국교수 딸은 AP Biology에서 5점만에 5점을 받았지요 (해마다 좀다르지만 미국 고등학생들중에서 AP Bio를 듣는학생비율은 전체학생의 10~20% 남짓인데 AP Bio들은 10%남짓의 학생들중에서 상위5~7%에 또 들어야 5점을받습니다. )
그래서 위의 내용들에 대해서 이론적으로는 고등학교떄 이미 다알고있었다고봐도 무방합니다
다만 PCR 장비들이 비싸다보니 고등학교에서는 이론만배우고 실제로 실험하는건 생물학전공자의경우
대학교 1~2학년쯔음에 처음 직접 해보게되는게 일반적입니다.
(사실 1~2학년자를 전공자라고하기도그렇죠...)
위에 실험과정을 써놓은거 읽어보시면아시겠지만 그냥
테스트튜브에 dna랑 이것저것 정해진만큼넣고 기계에넣고 돌리고 이게끝인 단순 반복 노동이다보니...
차라리 레시피대로 스테이크 맛나게 굽는게 더어려울정도로.. 난이도자체는 낮은일입니다.
숙련된 생물학 전공자라면 위에 요약해둔거
2번~5번의 실험 과정을 끝내는데 필요한시간은 하루면 충분하다고봅니다
아침8시에 출근해서 밤8시에 퇴근하기전에 91명의 샘플처리 충분히가능합니다.
(PCR 한판이 12x8 96개입니다 91명샘플이면 한판도안되는거죠..)
실제로 저도 그렇게할자신있고
혹시나 contamination같은거떄문에 뻑나는부분있는거 감안해도 이틀이면 충분하고
데이터정리역시 하루면충분하다고봅니다
그래서 각각의 스텝에서 뭘할지를 가르쳐만준다면
고등학생이 이걸 2주에걸쳐서 끝내고 남은 4개월동안 논문작성에기여하는거는 충분히 가능한일이라봅니다
(여름에 2주인턴인데 논문제출은 12월에되었으니 논문작성기간은 2주에 포함안되고 4개월가량있는걸로이해했습니다.)
그리고 위의 전반적인 실험에서
고등학생이 교수의 많은 도움없이 이해하거나 하는게 불가능하다고 보는부분은
1. HIE와 eNOS에 대한 배경지식과 그를 기반으로한 전반적인 논문기획및 reference로 쓸 선행연구자료수집
2. PCR할떄 primer를 뭘쓸지 선행연구보고 디자인하기
3. Restriction Enzyme을 선행연구보고 뭐쓸지 정하기
이정도라고보네요.
그리고 논문수준자체는 솔직히 이게 논문이맞나... 이게 어떻게 저널에 실렸지싶을정도로
논문내용도단순하고 실험방법도 간단하고 결론도 그닥유용하지않은...수준이라고봅니다 (고등학생에딱어울리는정도요)
결론 : AP Bio 5점받은 고등학생이 충분히 쓸수있는수준임
다만 마지막에 지적하신 3가지 부분이
고등학생 레벨에서 생각하기 어려운 부분이고
이점에 대해 조민양이 교신저자와 토론하기엔 아직 배경 지식이 많이 부족햐죠.
따라서 이 논문의 저자는 교신저자 본인이 되어야 합니다.
다만 이 논문 1저자가 조민양이 된 점에 대해 조국 교수와 조민양에게 책임을 물을 순 없습니다.
어쨌든 자기 수준에서는 이해가 안가니 또 '고등학생이 어쩌고 저쩌고' 댓글 달리겠군요.
그냥 대학교 신입생들 랩 견학가서 대충 하루 안에 끝내는 정도의 난이도에,
심지어 PCR 기계는 요새는 중국산도 있어서 1-200만원 정도라 그렇게 부담되는 것도 아니구요.
프라이머 넣고 엔자임 넣고 PCR 돌려놓고 (약 2-3시간)
제한효소로 자르고 (약 1시간)
전기영동 돌리면 (병렬 처리로 샘플 90개 동시에 했다면 약 1시간 예상)
저 데이터 결과는 심지어 SPSS 돌릴 필요도 없고 엑셀로도 처리가 되서 5분이면 결과 나오는....
심지어 밴드 강도 보는 것도 아니라서 로딩 양도 중요하지 않으니 전기영동 조차 대충 해도 되는데...
이런 실험하는데 솔직히 PCR 원리와 제한효소 원리를 전부다 이해할 필요가 있을까요?
'그냥 효소 넣고 처리하면 잘렸으니까 저 샘플은 그 염기서열 있다고 보면 되는거야.' 이 정도만 알면 되는거.
거기에 PCR이나 프라이머 등등은 요새 수능 생명과학에 문제로 나올 정도인데 뭐 교과 외 과정도 아니고.
(참고로 일본 높은대학 본고사에서는 플라스미드 정보 줘놓고는 저런 실험을 아예 설계하고 설명하라고 문제로 나옵니다.)
5-6시간 쯤 걸리는 실험이죠. 심지어 PCR 돌려놓는 동안 다른 실험 준비도 할 수 있는....
솔직히 조국 딸이 초본 작업한 파일까지 검찰에서 발견했는데도 이걸 문제 삼는건 어이가 없구요
저정도라면 좀 똑똑한 고딩은 할 수 있는거고 딸 성격상 성실하게 잘 수행했겠구나 싶습니다
생물학 약간만 맛보신 분들은 알겠지만, 90년대 한국 생물학 연구실 석사 1년차들도 문제없이 수행하던 수준의 실험입니다. 실험 디자인도 평범한 수준이고, 2010년대라면 생물학에 관심있는 고등학생도 할 수 있는 정도라고 봅니다.